< Terug naar partner overzicht

03 - Vito

Extracellulaire vesikels (EVs) zijn kleine blaasjes die worden afgegeven door levende cellen. EVs dragen een specifieke subset van biomoleculen die hun oorspronkelijke celtype en -conditie weerspiegelen.

Bij cardiovasculaire aandoeningen (CVD) vertegenwoordigt de afgifte van EVs uit ontstoken endotheel in het bloed een biologisch significant communicatiesysteem. EVs dragen hun inhoud over naar bijvoorbeeld monocyten, wat gepaard gaat met het herprogrammeren van de monocyten. Dit ondersteunt waarschijnlijk weefselherstel. De met EV geassocieerde biomoleculen bevatten dus een rijke bron van informatie over de cellulaire processen bij CVD en zijn veelbelovend voor diagnostische en therapeutische doeleinden.

Omdat EVs van zieke cellen die in het bloed circuleren meestal in de minderheid zijn door de grote aanwezigheid van EVs uit gezonde cellen, zijn workflows nodig voor de fractionering van ziektespecifieke EV-subpopulaties. Scheidings- en analysemethoden van single EVs gebaseerd op meerdere parameters zijn in toenemende mate interessant voor dit doel, omdat ze de gevoeligheid en specificiteit van detectie kunnen verschaffen die nodig is voor klinische diagnostiek. Een flow-cytometrie-instrument met hoge resolutie voor single vesicle sortering en analyse is geïnstalleerd bij VITO (figuur 1) en kwaliteitsborgingsprotocollen voor fluorescente EV-kleuringen gericht op EV-subpopulaties van interesse zijn geoptimaliseerd. Deze in Vlaanderen unieke infrastructuur is gebruikt in een pilotstudie naar het effect van de pro-inflammatoire stimulus TNF-α op de EV-uitscheidingsprofielen van in vitro gekweekte menselijke macrofagen. Een tweevoudige toename in het aantal uitgescheiden EVs, evenals een verandering in eiwitexpressie op macrofaag-afkomstige EVs is aangetoond (figuur 2). Sorteren van dergelijke informatieve EV-subsets maakt het mogelijk EV-geassocieerde biomoleculen specifiek voor CVD-aandoeningen te ontdekken en/of te verifiëren wat ons uiteindelijk kan helpen bij het ontwikkelen van verbeterde diagnostische tests.

website

Figuur 1: Hoge resolutie flow-cytometer BD-influx voor het sorteren en analyseren van kleine deeltjes op VITO.

Figuur 2: Effect van tumornecrosefactor-alfa (TNF-α) op (A) het aantal en (B) CD54/ICAM-1-expressie van EVs afgeleid van THP-1-macrofagen. Cellen werden overnacht geïncubeerd in medium dat 2% EV-vrij serum bevatte, aangevuld met 30 ng/ml TNF-α. Uitgescheiden EVs werden geïsoleerd met behulp van ultracentrifugatie en fluorescent gekleurd met de intra-luminale kleurstof Carboxyfluoresceïne diacetaat succinimidyl ester (CFDA-SE) en een anti-CD54-PECy5 monoklonaal antilichaam. Vrije kleurstof en antilichamen werden verwijderd met behulp van dichtheidscentrifugatie op een sucrosegradiënt. Vesikelfracties werden verdund (1:20) in PBS en EVs werden geanalyseerd in 30 sec met behulp van hoge-resolutie flowcytometrie op een BD Influx-instrument.